施佳宏、郭華仁 1999 木瓜種子的TTC檢查法。植物種苗 1: 47-56。
Shie, C.H. and W.H.J. Kuo 1999 Tetrazoloium Test for
the Seed of Carica papaya L. Seed and Nursery (Taiwan) 1: 47-56.
Tetrazoloium Test for
the Seed of Carica papaya L.
Chia Hong Shie1） and Warren H.J. Kuo2）
Department of Agronomy, National Taiwan University,
Taipei 107, Taiwan.
1）Present address: Taiwan Tea Experiment Station,
Taoyaun, Taiwan.
2）Corresponding author.
SUMMARY
Non-dormant papaya seeds subjected to different
accelerated-aging levels are used to evaluate the pattern of the TTC-stained embryo. The
procedure of TTC testing for papaya seeds is proposed as follow: Soak the seeds in water
over night, then remove the testa and endosperm. Stain the de-coated embryo by 0.5% TTC
solution at 37.5℃ for 3 hours. Twelve categories are sorted out from the patterns of TTC
staining. (fig 1) Halve of the embryo of a seed lot
which containing only 2.5% viable seeds stained red, which deviate from viable one only by
a slightly tint of opaque. (fig 2) The viability
status of each category is determined by the calculation of minimum root mean square
method. (table 1) The criteria for the evaluation of staining
pattern thus determined predict the germination percentage of papaya seeds of different
sources and cultivars accurately. (table 2) In order to
harmonize with the ISTA rules, it is suggested that, the maximum area of unsuccessful
staining for a viable papaya seed to be 1/3 radicle, with a remark that the red colour
with an opaque or glassy appearance should be considered as dead.
Key Words: Carica papaya L., seed, TTC,
TZ test
木 瓜 種 子 的 TTC 檢 查 法
施佳宏1）、郭華仁2）
台北市 國立台灣大學 農藝學系
1）現任桃園埔心茶業改良場助理
2）通訊作者
用不同加速老化程度的木瓜種子釐定TTC染色結果的研判。檢驗程序建議如下：種子經25℃浸水隔夜後，去除整個種皮及胚乳。裸胚以0.5﹪TTC溶液於37.5℃染色3小時；胚經TTC染色後可分類為12種染色型式。活率最低（2.5%）的樣品幾乎有一半的種子可以染成紅色，不過該等紅色略具粉紅不透明感。以最小根均方法求出染色型式的研判準則。經由根均方法所確立的染色評估準則能精確地預測不同來源及不同品種的木瓜種子的發芽率。本報告建議，依照ISTA種子檢查規則的格式，木瓜種子TTC檢驗的研判準則是：可容許的染色失敗最大範圍為胚根根尖1/3，所染的紅色若帶粉紅不透明感或水玻璃感，則為死種子。
關鍵詞：木瓜、種子、
TTC、TZ法
前 言
木瓜（Carica
papaya L.）為我國重要經濟果樹之一，通常以種子繁殖，因此維持種子高品質的要求甚鉅。種子品質的測定以發芽率的測定為主。然而，由於木瓜種子常具休眠性，發芽試驗的結果可能低估種子的存活率；此外，木瓜種子的發芽試驗常需要三週以上，在需要快速得知檢查結果時，無法作為有效的測驗方法。
利用TTC或TZ法（Tetrazolium test）檢驗種子發芽能力已廣泛應用於多種植物。應用TTC法在預測種子存活率與實際發芽率之間確有明顯相關性存在，且已普遍應用於許多農藝，園藝及林木種子（ISTA,
1993）。此法的原理是活細胞內脫氫𠕇活性能將無色的氯化四唑（tetrazolium
chloride）還原成不溶於水的紅色沉澱之化合物formazan，formazan不能滲出細胞外，因此死亡細胞中則仍維持為無色。依據胚及胚乳染色的分佈部位及顏色深淺，即可判定種子的存活率（李，1983；Moore, 1985），而不受休眠的限制。
種子的TTC檢驗法已成為若干種子的例行檢查項目，用來取代一般的發芽試驗（郭，1990），即便在我國，也早就有詳細的引介（如：宋，1964；李，1983）；然而，此方法在我國種子學研究中較不多見，種子檢查單位迄今也尚未採納為檢查的項目。
各種種子TTC法的操作步驟，因不同植物而異，染色後死活的判定準則亦各有所不同（ISTA,
1993）。由於木瓜種子尚無相關資料可循，因此本研究擬針對染色的程序及判別準則加以探討，以期提出木瓜種子的TTC檢驗法。
材料與方法
以‘台農二號’木瓜單交種子為試驗材料，將含水率12%的種子密封後在47.5℃下處理0-10天，以得到七級不同老化程度種子，分別進行發芽率試驗與TTC染色。
種子發芽率的測定是先將種子浸於500 ppm的GA3溶液一天後，採用捲紙法，置於30/25
℃（8/16 h）變溫照光之生長箱進行發芽試驗（施與郭，1996）。每處理重複4次，每重複50粒種子。以下胚軸長達1.5 cm以上，子葉自種皮脫出，可判定為正常苗時視為發芽。置床期間為30天，結束後計算發芽百分率。
取種子樣品4重複，每重複50粒，進行TTC檢驗的研究。染色方法參考ISTA（ 1993 ）的檢查程序，並經不同染色溫度、TTC濃度以及浸潤時間等預備試驗的結果，將木瓜種子TTC檢驗程序訂為：
1.種子浸水6-18小時（25℃黑暗中）。
2.以夾子及鑷子去除外種皮及內種皮。
3.以鑷子及矛狀挑針將胚從胚乳中取出，操作過程中避免傷及胚。
4.裸胚放入稱量瓶中，倒入0.5%的TTC溶液於37.5℃黑暗下浸潤3小時。
5.水洗胚後於解剖顯微鏡下觀察判斷。
先將每個胚的染色結果依子葉與胚根的染色情形逐粒登記成多個型態，記錄每個型式的粒數。全部樣品皆染色之後，參考
Moore（1985）及ISTA（1993）的分類判斷原則，將全部染色結果歸納成12型式。理論上每型式可能代表死或者活種子，因此判斷準則應有212個可能的組合。這些準則是否可靠，則是用RMS（root mean square）法來決定（Kuo
et al., 1995）；RMS的計算如下：
RMS= [(G1-P1)2
+ (G2-P2)2 +......+ (Gi-Pi)2
+...... +(Gn-Pn)2 )/n]0.5
其中Gi為第i包（批）種子真正發芽率；Pi為第i包（批）種子經TTC檢驗後，在某判斷準則下之預測發芽率；n為全部樣品包（批）數。比較各種判斷準則的RMS，以獲得最小RMS的判斷準則作為正確的判斷依據。
另取泰國種一批、‘日陞’兩批、‘台農一號’一批、‘台農二號’兩批，
‘台農二號’果實所採的種子三批，以及‘台農五號’果實所採的種子一批，分別進行發芽試驗與TTC檢驗結果的比較，以檢定經前述程序所訂立的TTC染色研判準則。
結果與討論
TTC法的要點是，種子先行前處理，使胚部得以與TTC溶液充分接觸。預備試驗顯示，各種較為簡易的操作方式，包括剪殼、抽氣（Knierim
and Leist, 1988）等，皆無法有效地將木瓜胚染色，因此需將裸胚取出並浸潤TTC溶液。此法雖較為繁瑣，但無其他選擇。不同老化程度的木瓜種子經TTC染色後顯示，胚染色的型態多所不同；依染色部位及色澤分成12種染色型式（圖1），其中第1型者全胚染色呈均勻鮮紅色。第2型者全胚染色呈均勻鮮紅色，但胚根約1/2處至胚根基部間呈淡紅色。第3型者胚根及至子葉組織約1/2處染色呈均勻鮮紅色，其餘子葉組織則顏色較淡。在這三個型式中，偶見根尖末端處染色很淺或不染色，根據ISTA的研判準則，應不影響判斷，因此不另歸類。
第
4型者子葉染成鮮紅色，但胚根前端約1/3至1/2處未染色或為淺紅色，其餘胚根組織染色正常，呈均勻鮮紅色。第5型者胚根染成鮮紅色，但子葉組織呈淺紅色帶透明狀。第6型者子葉染成均勻鮮紅色，但幾乎整個胚根未染色或染成淡紅色。
第
7型者全胚染色正常，與第1型之染色結果相近，但紅色之色澤較淺，有些胚組織呈均勻不透明狀粉質感。第8型者子葉染色結果與第7型相同，但胚根約有1/3部位甚至整個胚根呈染色很淺或不染色。第9型者子葉幾乎不染色或子葉呈白色但帶有如葉脈般之紅色網紋狀；胚根染色正常或局部不染色，或染色較淺。
|
1.whole
embryo stained red.
2. basal part of the radicle stained light red, the rest part
red.
3. distal half of the cotyledons stained light red, the rest
part red. Those less than 1/3
radicle tip unstained are not excluded from the above 3 patterns.
4. more than 1/3 radicle tip unstained.
5. cotyledons stained glassy red.
6. radicle unstained.
7. whole embryo stained red, with a tint of opaque.
8. more than 1/3 radicle tip unstained, the rest part glassy
red.
9. cotyledons unstained.
10. basal part of both radicle and cotyledons stained light
red.
11. whole embryo stained light red.
12. whole embryo unstained. |
圖 1，木瓜胚的12種TTC染色型式。其中僅1，2，3型為活種子，詳正文。
Fig. 1, Twelves TTC-staining patterns of
the embryo of Carica papaya L. Only pattern 1, 2 and 3 are considered viable.
第10型者胚根前端約1/2處及子葉末端約1/2至1/3處染成鮮紅色，其餘組織則染色很淺或不染色。第11型者全胚皆均勻染色，但色澤呈極淺之淡紅色，有些子葉組織為極淺之淡紅色且略帶透明狀。第12型者全胚完全無染色，組織呈白色，有些胚根或胚根之局部呈些微且色澤極淺之淡紅色。各級老化程度種子的染色分布不一，但可見染成型式1與2的數目隨著種子劣變程度的加深而減少。較特殊者是發芽率僅2.5%的樣品，染色的結果幾近一半的胚可以全面染成紅色略帶不透明感
的粉質，與第1型的紅色僅有微小的差異，應屬於型式7（表1）。木瓜種子經TTC檢驗後之12種染色型式判斷準則，較國際種子檢查規則上所列的小麥、大麥、黑麥及燕麥等的分類型式為多，但與Pasha和Das （1982）之大豆10種TTC染色結果相接近。由於染色型式種類太多，而且包括不易研判如第5或7型者，使得如何將之歸類為死或活的種子更為困難。用於木瓜與一串紅（Salvia
splendens Sell ex Roem.）種子的RMS法（Kuo et al., 1995），則可以客觀地克服此困難。
表 1，不同老化程度木瓜種子經TTC檢驗後胚分布於各染色型式的數目
Table 1,
Distribution of embryos to each stain pattern after TTC tests of the papaya seeds 1）
of different aging level
Stain pattern |
Aging days under 47.5℃ and 12% seed moisture
content |
sum |
0 |
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
6 |
1 |
142 |
157 |
113 |
143 |
95 |
61 |
0 |
711 |
2 |
23 |
9 |
32 |
4 |
1 |
1 |
0 |
70 |
3 |
4 |
1 |
1 |
0 |
2 |
0 |
0 |
8 |
4 |
2 |
7 |
7 |
12 |
44 |
47 |
0 |
119 |
5 |
2 |
1 |
22 |
8 |
7 |
13 |
0 |
53 |
6 |
2 |
3 |
0 |
5 |
9 |
14 |
0 |
33 |
7 |
10 |
1 |
6 |
7 |
11 |
16 |
96 |
147 |
8 |
4 |
3 |
1 |
2 |
3 |
17 |
4 |
34 |
9 |
6 |
9 |
9 |
12 |
22 |
17 |
40 |
115 |
10 |
2 |
3 |
1 |
1 |
0 |
1 |
4 |
12 |
11 |
0 |
0 |
0 |
2 |
0 |
1 |
16 |
19 |
12 |
3 |
6 |
8 |
4 |
6 |
12 |
40 |
79 |
sum |
200 |
200 |
200 |
200 |
200 |
200 |
200 |
1400 |
| Germination 2） |
84 |
85 |
72 |
68.5 |
49 |
27 |
2.5 |
|
1） Cultivar‘Tainung no. 2’
2）
%
Normal germination, + GA3
依照TTC法原理中的染色研判準則，第4、6、8、9、10、11、12型式者為死種子應無疑慮，然而其他型式則較難判斷。因此根均方（RMS）的計算只需要針對第1、2、3、5、7型式，也就是25個組合。計算結果顯示，若將第7者視為活種子，所得到的RMS皆高過10，表示此染色型式代表死種子（不列入表2）。由表2所列的部份RMS計算結果可知，以第1、2、3型式研判為活種子，其餘為死種子最佳。在TTC染色結果如何判別上，RMS法可以提供較為客觀的比較（Kuo
et al., 1995）。然而此種計算方法若用在具有休眠性的種子時，可能造成研判準則的錯誤。因為若種子具有休眠性，而且無法用人為的處理完全促進種子發芽時，則前述的實際發芽百分率仍然低估樣品的真正活率，因而所做的統計分析將產生誤差。由於木瓜種子可能具深度休眠（施，1995），本試驗採用無休眠種子來進行加速老化處理，所得的低發芽率種子，確定並非休眠所引起。因此第5或7型式的染色，雖然全胚皆能染成略帶透明狀或粉狀的紅色，透過RMS的計算，仍應判為死種子。
表 2，木瓜胚TTC染色型式視為活種子所預測的存活率與實際發芽百分率之間差異的均方根
Table 2, Root mean square determination 1）
for the representation of some TTC staining pattern
Patterns considered as viable 2） |
Root Mean
Square |
1,2,3
|
2.69
|
1,2
|
2.8
|
1,3,5
|
6.66
|
1,2,5
|
6.95
|
1,2,3,5
|
7.14
|
1,5
|
7.17
|
1,3
|
7.46
|
1
|
8.29
|
1）RMS of the
difference between germination percentage and TTC-predicted viability percentage,
calculated from the data of table 1.
2）
Those pattern combinations that
yield RMS larger than 9.0 were omitted.
另取已知全死的種子來染色，的確得到全胚皆可染紅者如圖2所示，是屬於於第5或7式。Ganguli
et al.（見Gitali and Sen-Mandi, 1992）發現老化的小麥胚也能染成紅色，若按照一般的判斷準則，視為活種子，會導致誤判。由於木瓜種子經過人工老化處理，這些死種子仍能染成紅色，暗示胚部的酵素仍具活性。由RMS的計算，擬定染色型式5或7者為死種子，與圖2經加速老化的死種子來染色的結果相符。然而這並不表示未經加速老化的樣品就沒有這種誤判的機會。在本試驗中，未經老化處理者（表1中老化0天），仍有部份種子的染色呈現型式5或7，因此在進行木瓜種子例行的TTC檢驗時，仍需要注意染成不透明感的粉質紅色者，或淺紅色帶透明狀者，將之判為死種子。
 |
圖 2，木瓜活（上）與加速老化而死的（下）種子經TTC檢驗後胚的染色。
Fig. 2, The result of TTC test of viable (upper) and dead (lower) seeds of Carica papaya
L. The dead seeds were obtained by accelerated aging. |
所確定的TTC染色判定準則，用來預估另10批種子的活率時，會高估未加GA3處理的發芽率（表3），其原因應是供試種子批具休眠性所致。Moore（1962）亦指出，利用TTC法測定某些林木類種子時，若預測活力值較實測發芽率高者，即可能因種子具休眠性所致。若在發芽前預浸GA3，則TTC法的預估相當準確（表3）。由於某些休眠性高的木瓜種子，即使加GA3處理，發芽率仍不高（施，1995），因此本文所提出的TTC法應可以避免木瓜種子發芽試驗實因種子休眠性所造成的誤判。
表
3，十批木瓜種子的發芽率與TTC所預測的存活率
Table 3,
Germination percentage and TTC-predicted viability of 10 papaya seed accessions
Viability, % （TTC test） |
Normal germination, % |
| +
GA3 |
－GA3 |
| 99.5±1.0 |
94.5±4.7 |
44.0±7.3
|
| 99.3±1.2 |
99.5±1.0 |
93.5±3.4
|
| 98.5±3.0 |
98.0±1.6 |
62.5±14.2 |
| 96.0±2.0 |
89.0±3.5 |
84.0±5.9
|
| 92.5±1.9 |
88.0±5.9 |
74.5±9.2
|
| 76.7±3.1 |
75.5±2.5 |
52.5±6.0
|
| 72.5±5.0 |
66.0±6.7 |
34.0±7.1
|
| 65.0±18.0 |
61.0±5.3 |
51.0±7.4
|
| 16.0±17.5 |
16.0±9.4 |
17.0±4.8
|
| 10.5±5.0 |
12.5±5.5 |
14.0±2.8
|
Mean 72.7 |
70 |
52.7 |
為了簡化染色的研判準則，再詳細觀察圖1，似乎可以將木瓜種子TTC檢驗法的研判準則依照ISTA規則（1993,
表6A）的格式，在「研判（可容許的最大無染色、軟弱、或壞疽的最大範圍）」欄中註明：胚根根尖1/3；而在「備註」中則註明：所染紅的顏色若帶粉紅不透明感，則為死種子。
由於木瓜種子TTC檢定程序中，取胚的操作過程較一般種子更為繁難且費時甚久，尤其需具熟練取胚技術的人員操作之，否則極易失敗。特別是部份死種子的胚仍可以全部染色，對此類種子，需要仔細分辨胚所染色澤，是本法的缺點。如何克服此一瓶頸，為進一步改善木瓜種子TTC檢查法所應努力的方向。
由於TTC法的準確性有賴於檢驗者的經驗，因此，在TTC法尚未十分確立的我國，檢驗者所面臨的最大問題，特別是針對沒有經過研究的物種，就是染色結果的判斷是否正確。在無具有經驗者的指導下，可以利用本研究所採取的RMS法來進行自我練習。取多批不具休眠性，但種子發芽率高低不同的樣品來進行染色。將胚染色結果劃分成若干型式，然後將染色的預測種子活率與實際的發芽百分率進行統計的比較，可以客觀地指稱各染色型式，特別是不易判斷的染色型式，所代表的種子狀態。
誌 謝
本試驗在農委會計畫（85科技-1,4-糧-05）經費支助下進行，又承鳳山熱帶園藝試驗所王德男主任、林瑩達先生，種苗改良繁殖場洪洲課長，台東區農改場李善忱先生，以及屏東泰和農場歐東坡經理、台南玉井鄉陳來明先生等協助提供種子，林美華小姐提供圖2，在此一併致謝。
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收件
received：1998-08-07；接受 accepted：1998-09-08